정여창(鄭汝昌)의 학문과 덕행을 기리고 지방민의 유학교육을 위하여 1552년(명종7)에 지었다. 1566년(명종 21)에 나라에서 ‘남계(?溪)’라는 사액을 내려 공인과 경제적 지원을 받게 되었다. 정유재란(1597)으로 불타 없어진 것을 1603년(선조 36)에 나촌으로 옮겨지었다가,1612년(광해군 4) 옛 터인 지금의 위치에 다시 지었다. 숙종 때 강익(姜翼)과 정온(鄭蘊)을 더하여 모셨다. 따로 사당을 짓고 유호인(兪好仁)과 정홍서(鄭弘緖)를 모셨다. 별사는 1868년(고종 5)에 훼철되었다. 정여창을 모신 서원은 전국적으로 9곳에 이르며, 그 중 주된 곳이 남계서원이다. 소수서원에 이어 두 번째로 세워진 남계서원은 흥선대원군의 서원철폐 때에도 존속한 47개 서원중의 하나이다. 2009년에는 사적 제499호로 지정되었다.

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